非小细胞肺癌 (NSCLC) 仍然是全球癌症相关死亡的主要原因,大约20-25% 的病例存在KRAS突变。KRAS-G12C突变发生在大约14% 的肺腺癌中,已成为精准医学策略的关键目标。虽然包括sotorasib和adagrasib在内的KRAS-G12C抑制剂已在临床试验中显示出希望,但其功效受到原发性和获得性耐药机制的限制。这项研究探索了将多靶点酪氨酸激酶抑制剂安洛替尼与KRAS-G12C抑制剂联合使用以克服NSCLC治疗中的这些耐药性挑战的潜力。我们的结果表明,在体外和体内,安洛替尼改善了原发性和获得性耐药环境中对KRAS-G12C抑制剂的敏感性。机械地,组合疗法抑制c-myc/ORC2信号传导,导致细胞周期停滞和细胞凋亡。这些发现表明,安洛替尼和KRAS-G12C抑制剂的组合代表了KRAS-G12C-mutant NSCLC的有希望的新治疗方法。
导言非小细胞肺癌 (NSCLC) 仍然是全球重大的健康负担,占全球癌症相关死亡的很大一部分 [
1]。NSCLC治疗中最有希望的发展之一是靶向KRAS突变,这种突变发生在20-25% 的病例中,历史上被认为是 “不可治愈的”,特别是KRAS-G12C突变 [
2,
3,
4]。KRAS-G12C突变存在于大约14% 的肺腺癌中,将其确立为精准医学方法的关键目标 [
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6]。KRAS-G12C抑制剂 (KRAS-G12Ci) 的开发,如sotorasib和adagrasib,已在临床试验中显示出有希望的结果,证明了先前治疗的KRAS-G12C突变NSCLC患者的适度获益,尽管总体生存率仍未改善 [
7,
8]。
KRAS-G12Ci的功效受到原发性和获得性耐药机制的限制 [
9]。在约60% 的患者中观察到的原发性耐药性可能归因于对KRAS信号缺乏依赖性 [
10]。获得性抗性通常涉及适应性非突变重编程和补偿性信号通路的反馈再激活 [
10,
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12]。为了应对这些挑战,已经提出了靶向多种途径的联合疗法,其中涉及KRAS-G12C抑制剂与靶向互补途径或耐药机制的药物的组合 [
12,
13]。在这种情况下,安洛替尼已成为联合治疗的有希望的候选者。
安洛替尼是一种新型的多靶点酪氨酸激酶抑制剂,已在各种癌症类型中显示出显着的抗肿瘤活性 [
14]。它主要针对血管内皮生长因子受体,成纤维细胞生长因子受体,血小板衍生生长因子受体和c-kit [
14,
15]。安罗替尼在NSCLC的临床试验中已证明有效,特别是在标准治疗后进展的患者中 [
16]。其抑制参与肿瘤生长和血管生成的多种途径的能力使其成为组合策略的有吸引力的选择。
在这项研究中,我们评估了安洛替尼与KRAS-G12Ci联合的抗肿瘤作用。我们的结果表明,这种组合抑制c-myc/起源识别复合物亚基2 (ORC2) 信号,诱导细胞周期停滞和凋亡,并且在原发性和获得性KRAS-G12Ci抗性条件下均在体外和体内发挥有效的抗肿瘤作用。这些发现确立了联合疗法作为克服KRAS-G12Ci抗性的有希望的临床策略。
方法细胞系和细胞培养在这项研究中使用了六种具有KRAS-G12C突变的NSCLC细胞系 (H2122、H2030、H358、H23、SW1573和Calu-1)。H2122和H2030购自中乔新洲生物科技 (中国上海); H358和H23购自中国科学院细胞库 (中国上海);SW1573和Calu-1均来自上海市胸科医院中心实验室。通过短串联重复序列 (STR) 分析鉴定细胞系。将细胞维持在补充有10% 胎牛血清 (GeminiBio) 、1% 青霉素-链霉素 (BasalMedia) 和1% GlutaMax (BasalMedia) 的rpmi1640培养基 (Gibco) 中。在标准培养条件下 (37 °C,5% CO2在潮湿的气氛中)。
试剂和抗体安洛替尼由正大天晴药业集团有限公司 (中国南京) 提供。Sotorasib、adagrasib和MG132购自MedChemExpress (newjersey,USA)。通过将sotorasib、adagrasib和MG132溶解在二甲基亚砜 (DMSO) 中,同时将安洛替尼溶解在无菌水中来制备储备溶液。将所有化合物储存在-20 °C下,并在使用前立即稀释至工作浓度。本研究中使用的主要抗体如下: 细胞周期蛋白B1 (Proteintech,55004-1-ap),细胞周期蛋白E1 (Proteintech,11554-1-ap),细胞周期蛋白D1 (Proteintech,60186-1-ig),CDK2 (蛋白质技术,603121-ig),GAPDH (蛋白质技术,HRP-60004),Mcl-1 (蛋白质技术,16225-1-ap),Bcl-2 (蛋白质技术,12789-1-ap),bax (克隆,A19684),Bid (abclonic,A23234),p-Erk1/2 (细胞信号传导技术,4370),Erk1/2 (细胞信号传导技术,4695),p-akt (细胞信号传导技术,4060),Akt (细胞信号传导技术,4691),β-肌动蛋白 (abclonic,AC006),c-myc (细胞信号传导技术,5605),COPS5 (abclonic,A4087),eIF4E (ab克隆,A2162),ORC2 (Abcam,A15697)。
2D培养中的细胞活力和细胞生长测定使用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8; Dojindo实验室) 评估细胞活力。将细胞以3-5 × 10的密度接种在96孔板中3每个孔的细胞,并用指定的化合物处理72 °c。处理后,将细胞与CCK-8试剂在37 °C下孵育1和2 °C。使用酶标仪在450nm下测量吸光度。使用incucytezoom活细胞分析系统 (essenbioscience) 监测细胞生长。
协同作用分析使用多种方法量化药物联合作用。对于chou-talalay方法,使用CompuSyn软件 (1.0版) 计算组合指数 (CI) 值。CI值解释如下: CI < 1.0表示协同作用,CI = 1.0表示可加性,CI > 1.0表示拮抗作用。对于ZIP,HSA,Bliss和Loewe得分分析,根据用户教程使用Synergyfinder R软件包 (Zheng S,Wang W,Aldahdooh J 2022)。协同得分解释如下: 协同得分 < - 10表示拮抗作用;-10 < 协同得分 < 10表示可加性,协同得分 > 10表示协同作用。
集落形成试验为了评估长期细胞存活和增殖能力,以低密度接种细胞 (在六孔板中1000个细胞/孔或在96孔板中200个细胞/孔) 培养14天,每3天更换一次培养基。培养期后,吸出培养基,在室温下用4% 聚甲醛固定菌落15 ℃。固定的菌落用0.1% 结晶紫溶液染色30分钟。在用PBS温和洗涤以除去过量的污渍后,将板风干并拍照。使用ImageJ软件 (NIH,v1.54) 定量集落数目和大小。
伤口愈合试验将细胞以 ~ 80%-90% 汇合过夜接种到96孔板中,然后用IncuCyte伤口制造工具96-工具 (essenbioscience) 进行刮擦。除去分离的细胞后,补充含有所示化合物的新鲜培养基。使用IncuCyte Zoom活细胞分析系统监测和分析伤口汇合。
细胞周期和凋亡分析对于细胞周期分析,使用具有alexafluor 647 (CX004,Epizyme) 的EdU细胞增殖试剂盒,将细胞与10 μ medu在rpmi1640中孵育3小时。在用聚甲醛固定并用0.5% Triton X-100透化后,使用细胞周期染色试剂盒 (CCS012,MultiSciences) 用edu-alexafluor 647和碘化丙啶 (PI) 染色细胞。使用Attune NxT流式细胞仪 (thermofisherscientific) 进行分析。对于凋亡检测,使用膜联蛋白v-fitc/PI凋亡试剂盒 (AT101,MultiSciences),根据制造商的说明书,用膜联蛋白v-fitc和PI对细胞进行双染色。早期凋亡细胞定义为膜联蛋白V阳性/PI阴性,而晚期凋亡细胞为膜联蛋白V阳性/PI阳性。使用Flowjo软件 (flowj0llc,v10.8.1) 分析结果。
蛋白质印迹法使用补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液提取总蛋白。使用二辛可宁酸测定法测定蛋白质浓度。通过10% sds-page分离等量的蛋白质并转移至PVDF膜。在室温下用TBST中的5% 脱脂乳封闭膜1 °C,然后在4 °C下与一抗孵育过夜。然后将膜与HRP缀合的第二抗体在室温下孵育1 °c。使用电化学发光成像仪观察蛋白质条带。在Image Studio软件 (li-cor) 中分析结果。
转录组测序 (rna-seq)使用TRIzol试剂 (Invitrogen) 分离三个重复的总RNA。在illuminavenovaseq6000平台上进行文库构建和配对末端测序。对原始测序数据进行质量控制,并将其映射到人类参考基因组 (GRCh38)。使用DESeq2 R软件包 (Love MI,Huber W,Anders S 2014) 进行差异表达分析,并使用基因集富集分析 (GSEA) 进行途径富集分析软件 (UC San Diego和Broad Institute,v4.1.0)。差异表达基因定义为 | log2FC | > 2并进行调整p-瓦尔 < 0.05。
RNA提取和定量PCR使用FastPure细胞/组织总RNA分离试剂盒 (RC112-01,Vazyme) 按照制造商的方案提取总RNA。使用nanodrop2000分光光度计 (thermofisherscientific) 评估RNA质量和浓度。第一链cDNA使用hiscriptivall-in-One ultratsupermix (R433-01,Vazyme) 合成。使用taqpro通用sybrqpcr主混合物 (Q712-02,Vazyme) 在LightCycler 480仪器II (Roche) 上进行实时PCR。本研究中使用的引物的5至3序列如下:
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| forward GAAACCACCCCTACTCCTAATCC |
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| 前锋TAGATCGACGTGTAGTGAATGGG |
反向TGTCTGTGGCACCAATTATTCTT |
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反向CTATGATACCACCCGATTGCATT |
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| 前进TACCAGCCCTACAGTGAAGATAC |
反向ATCAGTTTGTTGTCAGATCCTCC |
质粒和siRNA转染将细胞以40-50% 汇合接种在六孔平板中并培养过夜。对于质粒转染,根据制造商的方案将DNA与lipofectamine3000和P3000试剂 (Invitrogen) 混合。人MYC (NM_002467.6) 的质粒由GeneChem (上海,中国) 构建。对于小干扰RNA (siRNA) 转染,将寡核苷酸 (20 μ m) 与lipofectamine3000混合。转染72小时后,将细胞重新接种到六孔或96孔板中用于后续实验。通过蛋白质印迹分析验证转染效率。
5至3的ORC2 siRNA序列如下:
si-ORC2 #1: GGUUCAACAUUGUGCUUUATT
si-ORC2 #2: CCUGUUGAUAAUGGAACAUTT
细胞衍生异种移植物 (CDX) 测定和体内治疗5周龄nu/nu雌性无胸腺小鼠皮下注射1 × 107细胞悬浮在100 μ lpbs中进入侧翼区域。使用数字卡尺每3天和4天测量一次肿瘤尺寸,并使用以下公式计算肿瘤体积: 体积 = 长度 × 宽度2 × 0.5。当肿瘤达到约200 °mm时3将小鼠随机分为四个治疗组。对于h23cdx,通过胃内施用用媒介物、索托拉西布 (60 mg/kg,每天) 、安洛替尼 (2 mg/kg,每天) 或组合 (索托拉西布加安洛替尼) 处理小鼠。对于H2122SR ⑶ x,用媒介物、索托拉西布 (100 °mg/kg,每天) 、安洛替尼 (2 °mg/kg,每天) 或组合 (索托拉西布加安洛替尼) 治疗小鼠。将索托拉西布溶解在1% 吐温80、2% HPMC和97% 水中,并将安洛替尼溶解在水中。当肿瘤超过1500毫米时,对小鼠实施安乐死3或在实验终点。收获肿瘤,称重,拍照,并在聚甲醛中固定24 °c用于随后的分析。所有程序均在上海交通大学医学院动物护理和使用委员会的批准下进行。
免疫组织化学将固定的肿瘤组织石蜡包埋并切片。组织切片进行抗原修复和内源性过氧化物酶阻断,然后在4 °C与针对Ki-67、c-myc或orc2的第一抗体孵育过夜。使用ocus20显微镜载玻片扫描仪 (Grundium) 扫描切片,并使用QuPath软件 (v0.5.1) 进行分析以进行定量评估。
组织微阵列 (TMA) 分析从长沙亚翔生物技术有限公司获得了包含80例NSCLC患者样本的组织微阵列 (TMA),以及相应的临床特征和生存数据。该研究得到了公司生命科学伦理委员会 (查询代码: PZEU12C6DYBMQT) 的批准。对TMA切片进行c-myc和orc2的免疫组织化学染色。使用QuPath软件 (v0.5.1) 分析染色的切片以定量评估蛋白质表达。
统计来自体外和体内测定的定量数据表示为平均值 ± 平均值的标准误差 (SEM)。使用双尾Student's确定组之间的统计差异t-测试两组之间的比较,或单向或双向方差分析 (ANOVA),然后进行适当的事后检验以进行多重比较。相关性分析采用Pearson分析。使用graphpadprism 10软件进行所有统计分析和图形表示。对于临床数据分析,使用kaplan-meier方法生成存活曲线。使用对数秩检验评估存活的统计学差异。P-值 < 0.05被认为是统计学上显著的。
结果安洛替尼增强体外原代和获得性耐药细胞对KRAS-G12Ci的敏感性为了探索安洛替尼联合KRAS-G12Ci在KRAS-G12Ci耐药环境中的作用,我们首先研究了sotorasib对具有KRAS-G12C突变的不同NSCLC细胞系的抑制效力。细胞系对sotorasib的敏感性差异显着: H358,H2122和H2030显示出高灵敏度,而H23,Calu-1和SW1573即使在高sotorasib浓度下也能保持活力 (图
S1A)。基于这些结果,将H23、Calu-1和SW1573分类为原代抗性细胞系。
为了研究获得性抗性,我们通过将H2122和H2030细胞暴露于增加浓度的sotorasib来建立获得性抗性细胞系 (H2122SR和H2030SR) (图。
S1B)。通过细胞活力测定证实了耐药性 (图。
S1C、D)。值得注意的是,原发性和获得性耐药细胞系均保持对安洛替尼的敏感性 (图。
S1E),H2122SR和H2030SR对安洛替尼稍微更敏感 (图。
S1F)。
细胞活力测定和协同作用分析显示,安洛替尼剂量依赖性地增强了sotorasib在所有五种耐药细胞系 (H23,Calu-1,SW1573,H2122SR,H2030SR) 中的作用,在大多数浓度组合中观察到协同效应 (图。
1A, B,
S2A-E,和补充表
1)。当安洛替尼与另一种KRAS-G12C抑制剂adagrasib联合使用时,观察到类似的效果 (图。
S2I, J)。与单独使用任何一种药物相比,这种组合显著抑制了细胞生长 (图。
1C, D和
S2F-H)。集落形成试验表明,安洛替尼增强了索托拉西布对长期细胞存活的抑制作用 (图。
1E, F和
S2K, L)。此外,伤口愈合试验表明,该组合更有效地抑制了抗性细胞系中的细胞迁移 (图。
1G-J和
S2M-P)。这些发现共同表明,安洛替尼在体外原发性和获得性耐药环境中均增强了KRAS-G12Ci的抗肿瘤作用。
图1: 安洛替尼在体外增强对原代和获得性耐药细胞的KRAS-G12Ci的敏感性。
A,B安罗替尼联合索托拉西布处理的H23细胞活力和联合指数 (A) 和H2122SR (B)。结果显示为平均值 ± SEM。使用具有Tukey多重比较检验的单向ANOVA确定统计学差异。粗体:p < 0.05。n = 3每组。CI: 组合指数,受影响的Fa分数,索托拉西布,安洛安洛替尼。C,DH23的细胞生长 (C) 和H2122SR (D) 用安洛替尼 (2 μ m) 加索托拉西布 (1 μ m) 处理,使用IncuCyte监测。结果显示为平均值 ± SEM。粗体:p < 0.05。n = 3每组。组合: 安洛替尼加索托拉西布。E,FH23的集落形成测定 (E) 和H2122SR (F) 用安洛替尼 (1 μ m) 加索托拉西布 (1 μ m) 治疗14天。结果显示为平均值 ± SEM。使用具有Tukey多重比较检验的单向ANOVA确定统计学差异。粗体:p < 0.05。n = 3每组。组合: 安洛替尼加索托拉西布。G-JH23的伤口愈合测定 (G,H) 和H2122SR (我,J) 用安洛替尼 (2 μ m) 加索托拉西布 (1 μ m) 处理48 h。结果显示为平均值 ± SEM。使用具有Tukey多重比较检验的双向ANOVA确定统计学差异。粗体:p < 0.05。n = 3每组。组合: 安洛替尼加索托拉西布。